核酸是生命活動中的最重要的動�(tài)生物分子之一??刂坪怂岬慕Y(jié)�(gòu)和活性可以極大地擴展了其在治�,生物傳�,納米技�(shù)和生物計算中方面的應(yīng)用潛�。目前已�(jīng)開發(fā)了基于小分子與光激活的方法來激活核酸的性能來對其結(jié)�(gòu)和功能的外部控制,這些方法都能一定程度地控制核酸的活�。但是目前存在的方法僅僅適用于天然核�,并且通常與聚合酶�(chǎn)生的序列不相�。同�,對核酸的熱觸發(fā)控制仍未開發(fā),在響應(yīng)性核酸技�(shù)中留下了重大空白�
乙二醛是一種在分子生物�(xué)中常用的化學(xué)變性劑,它與多個核堿基的沃�-克里克表面共價結(jié)�。同時乙二醛在高溫和弱堿性條件下容易脫保�。因此,使用乙二醛作為核酸籠蔽劑能夠逆轉(zhuǎn)加合物的形成和恢�(fù)堿基配對的能�?;�?,本文作者開�(fā)了一種基于乙二醛與堿基的熱可逆相互作�,可控地控制多種核酸支架�(jié)�(gòu)與活性的方法�
首先,作者在模型DNA鏈上驗證了乙二醛能夠籠蔽住DNA上的堿基,能夠破壞核酸的�(jié)�(gòu)和功能。同�,作者通過�(diào)節(jié)pH,溫度和孵育時間,實�(xiàn)了在條件下可以實�(xiàn)乙二醛的脫籠。緊接著,作者也證明了乙二醛可以影響小分子與適體相互作用以及DNA酶活性的完全抑制�
在該方法成功地應(yīng)用于天然DNA和RNA的骨架后,作者接下來將該方法�(yīng)用于非規(guī)范性異種核酸支架——蘇糖核酸(TNA)和肽核酸(PNA�。與DNA或RNA相比,TNA由重�(fù)連接2'�3'磷酸二酯鍵的蘇糖組成,而PNA由氨基乙基甘氨酸單元形成“肽”。由于它們的化學(xué)�(jié)�(gòu),TNA和PNA都對核酸酶具有抵抗力。作者評估了乙二醛的籠蔽對TNA與DNA互補的堿基之間的干擾,利用微尺度熱泳(MST)來測量雙鏈體的形成,發(fā)�(xiàn)乙二醛的籠蔽可以完全抑制雙鏈體的形成,而從TNA中去除乙二醛加合物,可以觀察雙鏈體形成的完全恢�(fù)。同�,乙二醛的籠蔽還可以可逆地破壞酶與核酸的相互作�,作者證明了sgRNA的籠蔽可以實�(xiàn)對CRISPR-Cas9活性的可調(diào)可逆的控制�
最�,作者將乙二醛的籠蔽�(yīng)用于提高PCR的特異性中。盡管PCR具有很高的靈敏度和效�,在使用過程中也容易引起脫靶DNA�(chǎn)物的非特異性擴增。這些問題中的許多是由于包括引物二聚體的形成和DNA模板�(nèi)的非特異性退火的原因造成�,這主要發(fā)生在早期PCR循環(huán)中的低溫步驟�。作者發(fā)�(xiàn)乙二醛的籠蔽可以有效破壞核酸雜交,并且在加熱條件下可完全逆轉(zhuǎn),從而防止脫靶引物相互作用并提高總體擴增特異�,有望用于基于高精度PCR的診斷�
總之,這項研究通過提供一種簡單有效的方法來對化學(xué)合成和酶促產(chǎn)生的核酸進行熱響�(yīng)控制,從而解決了核酸技�(shù)中的一個重大空白。此�,乙二醛籠蔽幾乎可應(yīng)用于任何核酸支架,提供了核酸活性控制的通用方法�
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